经典三级视频在线观看 南京信帆生物：酵母表达外源蛋白

1、 菌株

用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。

2、温度：
　在28度和室温下诱导表达，表达水平可能都不低。

3、pH

手册上用6.0，pH提高到6.8，不表达的蛋白可能就表达出来。BMMY的pH7.0-7.5比较合适。国内外做的的rHSA，zui适pH大概5-6左右。pH3的时候yeast和peptone好像会沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氢钾调，具体比例自己去试试。
 

4、偏爱密码子

codon bias一般不是主要的问题，你要表达的蛋白特性才是主要问题，酵母对分子量大（30KD以上），结构复杂（如一些蛋白酶），二硫键含量多的蛋白往往不能有效表达，尤其是分泌表达。密码子改造对一些较小的而且结构简单的蛋白表达量的提高可能有一些作用。比如一位战友用Pichia酵母表达一个单链抗体，29KD，含有2对二硫键，表达量约几毫克每升，选用酵母偏好密码子全基因合成后，表达量没有什么提高。

5、表达时间与空质粒转化对照

诱导时间长了以后，是会有很多蛋白分泌出来的，时间越长杂蛋白就越多，且分子量都比较大。做一个空质粒转化的对照，这样就会比较肯定到底是不是自身的蛋白分泌的结果。

6、污染

每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2ml BMGY摇菌（30ml玻璃管，比LB管大一点），纱布一般用8层，一天左右看着比较浑离心，留样1ml，余1ml换2ml BMMY诱导表达，3,4层纱布足够了。

污染一般都是跟瓶口覆盖有关的原因造成的，只盖纱布肯定会污染。加盖报纸后，就再没遇到过污染。如果只用6层纱布，污染的可能当然很大，100ml三角瓶，装量10ml培养液，用橡筋把8层纱布和2层报纸拴紧封口，空气浴摇床。

7、不表达

蛋白有没有表达就要看你的运气了，一般重复2－3次实验都没有表达菌株，这个蛋白就放弃表达了。

8、表达量

30KD,10mg/L表达量已经很高，zui直接的方法是发酵，一般提高5－10倍。大肠杆菌一样出现大团的超表达蛋白。

9、糖基化

酵母分泌表达的N糖基化是可以预测的，有如下序列：N X S/T就是潜在的糖基化位点，X为任意氨基酸，1个糖基化位点会加上1－3KD左右的糖基。另外可能还有O糖基化话，但是无法预测其位点，不过很少听说表达蛋白有O糖基化的。如果胞内表达，不存在糖基化的问题。

10、表型与表达

重组SalI和BglII酶切产生单交换和双交换，结果就是产生Mut+和Muts表型的菌株；前者在甲醇诱导表达时生长快，消耗的甲醇多，后者生长慢，消耗的甲醇少，所以诱导表达时Muts表型要求更高的菌体浓度。一般用Mut+表型的较多，但是对某些蛋白Muts菌株可能表达的更好，只有试试才知道你的蛋白用那种菌株表达较好。

11、培养基

YPD：zui基本的培养用；BMGY：诱导表达前培养用；BMMY：诱导表达用；MD：电转化后筛选his＋用。
YEPD是不能代替BMGY的，因为有葡萄糖，这样残留的葡萄糖会影响下一步的诱导表达。不过有一种方法是可行的，就是用YPG培养基代替，只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。摇瓶毕竟不能和发酵罐比，甘油残余会抑制甲醇利用。

BMGY、BMMY灭菌后才能加甲醇、磷酸钾、*。配制BMMY时也没必要用5%过滤除菌的甲醇，在灭菌后使用前加甲醇至你要的浓度。

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